Potential Impact of ALKBH5 and YTHDF1 on Tumor Immunity in Colon Adenocarcinoma

ALKBH5 和 YTHDF1 对结肠腺癌肿瘤免疫的潜在影响

由背景，只要能证明两个基因在CRC与正常人中差异表达，且与免疫相关。这个文章就有创新价值了。之后再比较两簇

肿瘤中某个高，正好正常组织中另一个高
两者跟免疫细胞相关
两簇之间比较

eraser and reader
背景：ALKBH5 和 YTHDF1 分别被视作 N6-甲基腺苷（m6A）修饰中的“擦除者”和“阅读器”。近来，就癌症的进展与治疗而言，免疫环境愈发受到关注。本研究旨在确定 ALKBH5/YTHDF1 与结肠腺癌（COAD）免疫学特征之间的关系。

方法：通过TCGA和GEO验证的表达数据，研究ALKBH5和YTHDF1在COAD患者中的表达情况。根据ALKBH5和YTHDF1的表达将COAD患者分为两组。比较两组患者的临床特征，并进行基因集富集分析（GSEA）以识别功能差异。使用ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA进行免疫浸润分析。此外，评估免疫检查点抑制剂（ICIs）的靶点表达，并计算肿瘤样本的肿瘤突变负荷（TMB）。使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与ALKBH5/YTHDF1表达和免疫功能相关的基因。使用GSE39582对两组之间的免疫特征进行外部验证。

结果：集群2中，ALKBH5 的表达较高，而 YTHDF1 的表达相对较低；而集群1则恰好相反。集群1的 N 期和病理期都高于集群2。集群2具有更强的免疫浸润，免疫检查点抑制剂（ICIs）靶标的表达更高，肿瘤突变负担（TMB）更多，且缺失性错配修复和微卫星不稳定性高的比例（dMMR-MSI-H）也大于集群1。此外，WGCNA（加权基因共表达网络分析）揭示了14个基因，包括 PD1 和 LAG3，这些基因与 ALKBH5 和 YTHDF1 的表达以及免疫评分相关。

结论：ALKBH5 和 YTHDF1 影响免疫环境，并有可能将结肠腺癌（COAD）患者的“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”。

介绍：

结直肠癌（CRC）在全球发病率中排名第三，死亡率在男女两性中排名第二（1）。大约70-80%的早期CRC患者符合手术条件，这些患者的五年生存率约为90%。然而，远处转移性CRC（IV期）患者的五年生存率低至10-15%（2, 3）。

结肠腺癌（COAD）是CRC的主要类型，起源于腺瘤病变，并因遗传突变的积累而演变为癌症（4）。最近的研究表明，突变可以生成新的抗原，这些抗原可以被免疫系统识别（5）。此外，免疫治疗已被证明对治疗晚期癌症有效（6）。然而，免疫治疗在某些微卫星不稳定（MSI）的患者和大多数微卫星稳定（MSS）的患者中存在局限性（7）。因此，识别新的免疫治疗标志物并揭示免疫检查点的潜在机制将是重要的。

微卫星(Microsatellite)，基因组中的一类短串联重复DNA序列，一般由1-6个核苷酸组成，呈串联重复排列。由于其核心重复单元重复次数差异，微卫星具有群体多态性。微卫星不稳定性(Microsatellite Instability，MSI)：与正常组织相比，肿瘤中某个微卫星位点由于重复单元的插入或缺失而出现新的微卫星等位基因的现象。MSI的发生是由于肿瘤组织的DNA错配修复出现功能性缺陷导致。伴随着DNA错配修复缺陷的MSI现象是临床上的一项重要的肿瘤标志物。

m6A对癌症
N6-甲基腺苷（m6A）是编码和非编码RNA中最丰富的RNA修饰，是多种癌症中重要的转录后调节因子（8-11）。参与m6A修饰的蛋白质可以分为三类：写入酶（催化m6A修饰的发生），去除酶（催化m6A修饰的移除）和读取酶（识别并结合m6A修饰）（12）。尽管肿瘤内在的致癌过程至关重要，但m6A修饰对肿瘤和免疫的影响也值得注意。近年来，一些研究建议，采用小分子抑制剂针对失调的m6A调节因子在癌症治疗中具有潜力。考虑到m6A修饰在各种癌症中的功能重要性，针对m6A调节因子的靶向治疗可以与化疗或免疫治疗相结合，以改善癌症治疗（13）。
转录后调节因子：在RNA水平修饰的因子

ALKBH5 在m6A修饰中发挥去除酶的作用，并被证明在黑色素瘤中调节抑制性免疫细胞的积累（14, 15）。在胰腺导管腺癌中，ALKBH5通过减少WIF-1 RNA的m6A修饰并介导Wnt信号通路来抑制肿瘤发生（16）。另一方面，YTHDF1 是m6A修饰中的读取酶，可以提高mRNA翻译的效率（17）。它以m6A依赖的方式调节溶酶体蛋白酶的表达，以控制抗肿瘤免疫并提高免疫治疗的有效性。缺乏YTHDF1可以增强PD-L1检查点阻断的治疗效果（18）。

为了全面理解ALKBH5和YTHDF1在肿瘤免疫中的角色，我们分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达综合数据库（GEO）的结肠腺癌转录组数据。我们根据ALKBH5和YTHDF1的表达将患者分为两个簇，并使用生物信息学方法比较它们在临床特征、生物途径、免疫浸润、免疫检查点表达和突变谱方面的差异。我们的结果表明，Cluster 2（ALKBH5高表达且YTHDF1低表达）具有更多的免疫浸润、免疫检查点抑制剂表达和肿瘤突变负担，提示Cluster 2可能对免疫治疗反应更好。ALKBH5和YTHDF1可能显著影响结肠腺癌的免疫环境。

MATERIALS AND METHODS

数据来源与预处理

转录组分析数据（HTSeq-Counts和HTSeq FPKM）及临床信息通过R（版本4.0.2）和R包TCGAbiolinks（19）从TCGA-COAD项目下载。纳入了包含完整临床信息（年龄、性别、T期、N期、M期和预后信息）的病例。435个原发性实体肿瘤样本的三级HTSeq-FPKM数据经过log2(FPKM+1)转换以进行进一步分析，HTSeq-Counts则用于差异分析。376名COAD患者的简单核苷酸变异数据（MuTect2）通过R包maftools（20）收集。由于部分COAD患者缺乏突变信息，因此在涉及突变谱的分析中仅纳入了376名患者。使用R包ComplexHeatmap（21）绘制瀑布图以展示患者的基因突变情况。肿瘤突变负担（TMB）基于简单核苷酸变异计算，定义为每兆碱基的突变数。通过基因表达综合数据库==（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）下载的GSE39582数组的表达谱数据==（22）用于验证结肠癌患者的免疫特征。

TMB在后面

免疫浸润分析

ESTIMATE是一种基于肿瘤样本中基因表达特征确定基质和免疫细胞比例的方法。它被应用于评估每位COAD患者的肿瘤微环境（TME），并通过R包estimate计算基质评分（基质含量）、免疫评分（免疫细胞浸润程度）、ESTIMATE评分（基质和免疫的综合标记）以及肿瘤纯度（23）。CIBERSORT是一种基于表达谱计算细胞组成的方法。该去卷积算法用于计算每位COAD患者中22种免疫细胞的比例（24）。每个样本中22种免疫细胞类型的比例总和为1。通过应用R包GSVA中的单样本基因集富集分析（ssGSEA）方法，我们根据28个已发表的免疫细胞基因集中的基因表达水平计算28种免疫细胞类型的浸润程度（26）。

基于ALKBH5和YTHDF1表达的共识聚类

consensus molecular subtypes

提取ALKBH5和YTHDF1的表达并使用R包ConsensusClusterPlus（27）进行一致性聚类。样本被分为两个簇。我们使用R包CMScaller识别每个样本的共识分子亚型（CMS）（28）。CMS是CRC的一个稳健分类系统。每个CMS具有不同的特征：CMS1（免疫型）、CMS2（经典型）、CMS3（代谢型）和CMS4（间充质型）（29）。使用桑基图表示两个簇与CMS之间的关系。

在2015年Nature Medicine上发表一篇关于结直肠癌的分子分型[1]，共收集18个数据集（6个分型研究）通过筛选共选取3,962 个样本，通过对数据清洗分析将结直肠癌分为4个亚型：CMS1（MSI免疫型），CMS2（经典型），CMS3（代谢型），CMS4（间充质型）。这四种亚型具有不同的分子特征同时可以评估患者预后，根据临床数据表明CMS4 型的总生存期和无复发生存期最差；CMS1型复发后生存期较低，CMS2型复发后生存期最高。

基因集富集分析

使用R包clusterProfiler进行GSEA，以发现两个簇之间显著的功能差异（30）。通过标准化富集分数（|NES| >1）、P值 <0.05和FDR q值 <0.05来识别显著的通路富集。

差异表达基因

通过比较表达谱数据（HTSeq-Counts），使用R包DESeq2（31）识别两个簇的差异表达基因（DEGs）。阈值设定为|log2FoldChange| >1和调整后的P值 <0.05。

加权基因共表达网络分析

我们使用R包WGCNA（32）对DEGs进行WGCNA分析。为了确保构建的共表达网络接近无尺度分布，我们选择了5作为软功率。我们获得了九个模块，并计算它们与簇、基质评分、免疫评分、ESTIMATE评分和肿瘤纯度的相关性。随后，根据模块成员资格（MM）和基因重要性（GS）计算获得了14个基因。

功能富集分析

使用R包clusterProfiler对14个选定DEGs进行基因本体==（GO）分析==（30）。然后，利用STRING数据库（33）构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。接下来，使用R包corrplot分析基因-基因、基因-ESTIMATE和基因-ssGSEA之间的Spearman相关性。

GEO三大富集分析
string在后面的视频

标本收集与实时定量PCR

从中国医科大学附属第一医院收集了12对CRC组织及其邻近组织，获得了知情同意和中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准。使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa）合成cDNA。根据制造商的协议，使用SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒（TaKaRa）进行RT-qPCR。引物序列如下：ALKBH5-F, 5′-CGGC GAAGGCTACACTTACG-3′；ALKBH5-R, 5′-CCACCAGCTTTGGATCACCA-3′；YTHDF1-F, 5′-ACCTGTCCAGCTAT TACCCG-3′；YTHDF1-R, 5′-TGGTGAGGTATGGAATCGGAG-3′；GAPDH-F, 5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′；GAPDH-R, 5′-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。

统计分析

所有统计分析均使用R（4.0.2）和==SPSS（25.0）软件进行。图形面板由Adobe Illustrator（CC 2019）==拼接而成。箱线图分析采用Wilcoxon秩和检验。相关性分析使用Spearman系数进行。卡方检验用于比较两个簇之间的临床特征（在需要时使用Fisher精确检验）。多元逻辑回归分析用于评估影响簇的临床特征。生存曲线使用Kaplan-Meier法构建（log-rank检验）。所有假设检验均为双侧，P值 <0.05被视为显著。

RESULTS

免疫相关m6A调节因子的鉴定及患者一致聚类

首先，我们计算了每个样本的四个ESTIMATE指标，以评估基质和免疫细胞的比例。为了探索m6A修饰在结肠腺癌（COAD）患者肿瘤免疫中的作用，我们鉴定了21个m6A调节因子，并评估了m6A调节因子表达与ESTIMATE结果之间的相关性（图1A）。考虑到与免疫评分的最高绝对相关值，我们将ALKBH5和YTHDF1纳入后续分析。接下来，在使用TCGA-COAD的RNA-seq数据进行Wilcoxon秩和检验时，发现肿瘤组织的ALKBH5表达低于正常组织，而YTHDF1表达则高于正常组织（图1B、C）。

随后，我们在435个TCGA COAD样本上根据ALKBH5和YTHDF1的表达矩阵进行一致性聚类，并将样本分为两个簇（图1D和补充图1）。热图显示簇1（n = 217）具有低ALKBH5表达和高YTHDF1表达，而簇2（n = 218）则具有低YTHDF1表达和高ALKBH5表达。由于这两个基因在两个簇中表现出相反的趋势，我们调查了ALKBH5和YTHDF1之间的Spearman相关性，发现呈现出微弱的负相关（R = -0.30，P = 1.34e-10）（图1E）。

为了更好地理解这两个簇的特征，我们评估了每个样本的CMS，并绘制了桑基图以指示二者之间的关系（补充图2）。

癌细胞从附近的内源性组织基质中募集支持性的基质细胞来促进肿瘤形成，因此基质细胞构成了肿瘤微环境的重要组成部分。基质细胞的组成在不同的肿瘤类型之间有很大差异，包括血管内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和星状细胞。一旦被招募到肿瘤微环境中，基质细胞分泌许多影响血管生成、增殖、侵袭和转移的因子（下图）。

图1A
ESTIMATE计算免疫评分
基因表达与免疫评分的相关性？
基因表达与免疫细胞比例的相关性 14

图1B、C
04

图1D和补充图1
18
聚类里面一个小图

图1E 补充图2
没找到

临床特征评估

为了确定两个簇之间临床特征的差异，我们首先绘制了生存曲线，结果发现两个簇之间预后没有显著差异（补充图3）。

Clinical features of two clusters.
相关分析显示，簇1具有更高的N期、更高的病理分期和较低的年龄（表1）。

Multivariate Logistic Regression for clustering (Cluster 2 vs. Cluster 1).
此外，多元逻辑回归分析显示年龄、T期和N期是影响聚类的独立因素（表2）。
#？
补充图3 15

通过GSEA鉴定免疫相关通路

进行了GSEA以了解两个簇之间的功能差异。所有差异表达基因（簇2与簇1）均纳入GSEA。我们在MSigDB Collection (c5.cp.v7.0.symbols.gmt) 的富集中发现许多与免疫相关的重要通路，包括适应性免疫反应、细胞杀伤、体液免疫反应、细胞因子产生的正调控、T细胞激活和T细胞增殖（图2A）。

图2A
24

免疫浸润比较

为更好地了解免疫功能的差异，进行了ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA分析。ESTIMATE分析显示，簇2的基质、免疫和ESTIMATE评分均高于簇1，而肿瘤纯度则较低（图2B–E）。此外，CIBERSORT分析显示簇2的CD8 T细胞比例更高（图2F）。ssGSEA显示25种免疫细胞亚型（例如活化B细胞、活化CD4 T细胞、活化CD8 T细胞、活化树突细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞）在簇2中的表达显著（图2G）。热图显示两个簇中28种免疫细胞亚型的整体情况（补充图4）。结果表明，簇2的免疫浸润程度明显高于簇1，尤其是CD8 T细胞。

图2B–E
08
图2F
19
图2G
20
补充图4
跟18差不多

免疫治疗敏感性评估

为了评估COAD患者对免疫治疗的敏感性，我们识别了一些在转移性结直肠癌临床试验中的免疫调节药物靶点。然后比较了两个簇之间这些免疫调节靶点的表达，发现簇2的免疫调节靶点（PD1、PDL1、PDL2、CTLA4、CD80、CD86、LAG3、TIM3、TIGHT、OX40、GITR、4-1BB、ICOS、CD27和CD70）显著高于簇1（图3A–D）。结果表明，簇2可能对免疫治疗的反应优于簇1。

基因突变比较

不同的基因突变会以不同方式影响免疫治疗的有效性，因此，我们评估了COAD的突变情况。两个簇之间的突变谱面景观如图4A、B所示。

簇2的TMB较高，且MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、POLE和POLD1突变数量多于簇1（图4C、D），这再次表明簇2的免疫治疗效果可能更好。

图4C、D
24

TMB 是指特定基因组区域内体细胞非同义突变的个数，通常用每兆碱基多少个突变表示（mut/Mb）

WGCNA与与m6A和免疫相关的中心基因鉴定

我们在两个簇之间获得了978个差异表达基因（721个上调和257个下调），结果使用火山图可视化（图5A）。随后，这些基因被纳入WGCNA分析（图5B、C）。为了识别与m6A和免疫相关的模块，我们对模块和特征进行了相关性分析（图5D）。

蓝色模块因其与m6A（R=0.32，P=6e-12）和免疫（R=0.85，P=3e-124）的相关性而被选中。随后，我们从该蓝色模块中获得了14个中心基因（WARS、SLC2A5、UBASH3B、NKG7、GNLY、GZMH、LAG3、GZMA、HAPLN3、CTSW、PDCD1、CCL4、RARRES3和KIR2DL4），其标准为模块成员资格（MM）>0.7和基因重要性（GS）>0.25（图5E）。

图5A
12

WGCNA分析（图5B、C）

中心基因的功能富集及其与免疫浸润的相关性

为了确定这14个中心基因的生化功能，我们进行了GO富集分析（图6A）。最显著的GO术语是免疫系统的负调控。我们还进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，并检查了基因之间的相关性（图6B、C）。基因与免疫浸润（ESTIMATE和ssGSEA）之间的Spearman相关性分析显示，大多数基因与免疫有显著相关性（图6D、E）。

GO富集分析（图6A）
17

GEO验证两个簇之间的免疫特征

首先，我们将来自GSE39582的566个结肠癌样本分为两个簇，方法与TCGA中的操作相同（图7A），发现ALKBH5和YTHDF1在这两个簇中的分布与TCGA中相似。我们还计算了ALKBH5和YTHDF1的Spearman相关系数（R = -0.36，P = 1.24e-18）（图7B）。

免疫调节靶点的表达及免疫浸润程度（ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA）也以同样的方式进行了评估（图7C–L）。簇2在免疫系统方面明显更活跃。

图7A
18

C-F
ESTIMATE免疫评分 8

G-J
基因表达量

K
CIBERSORT 19

L
ssGSEA 免疫细胞表达量20

CRC及其邻近组织中ALKBH5和YTHDF1表达水平的验证

我们使用RT-qPCR检测了12个CRC组织及其配对邻近组织中ALKBH5和YTHDF1的表达水平。结果表明，CRC组织的ALKBH5表达较低，而YTHDF1表达较高（图8）。

讨论

ALKBH5在结肠癌中表达水平较低；其过表达在体内抑制细胞转移，在体外抑制细胞侵袭，从而提示其作为肿瘤抑制因子（34）。最近的研究报告了ALKBH5在不同类型癌症中的表达和功能差异（35）。尽管ALKBH5已被证明与黑色素瘤患者对抗PD-1治疗的反应相关，但其在COAD患者中的表达与免疫治疗反应之间的关联仍不明确（15）。YTHDF1在CRC中高表达，并增强干细胞样活性（36）。YTHDF1的高表达可能导致免疫细胞丰度降低，因为高干性指数代表低免疫细胞比例和低PD-L1表达（37）。我们研究中COAD患者的ALKBH5和YTHDF1表达与先前的研究一致。此外，我们发现ALKBH5与YTHDF1之间存在负相关，提示它们的功能可能在m6A修饰上存在交叉或相互作用。先前的研究报告了ALKBH5以YTHDF1依赖的方式抑制非小细胞肺癌的肿瘤进展（38）。此外，它们在ESTIMATE分析中的免疫评分相关性正好相反。因此，ALKBH5和YTHDF1可能参与m6A修饰的调控，进而影响COAD患者的免疫浸润和免疫治疗反应。

我们应用共识聚类将TCGA中的COAD患者分为两个簇：
簇1（ALKBH5：低表达；YTHDF1：高表达）和
簇2（ALKBH5：高表达；YTHDF1：低表达）。此外，我们调查了这两个簇与CMS之间的关系。
我们发现CMS2主要被归类为簇1，而CMS1和CMS3主要被归类为簇2。CMS4没有差异。CMS1代表微卫星不稳定免疫型，具有高突变率、MSI和强免疫激活；CMS2代表具有显著WNT和MYC激活的经典型；CMS3代表代谢型，表现出上皮和明显的代谢失调（29）。
从CMS的角度来看，我们推测簇2可能具有比簇1更强的免疫浸润。随后，我们评估了它们的临床特征，发现簇1的N期高于簇2，这可能是由于ALKBH5对转移的抑制。为了进一步研究这两个簇之间的功能差异，我们使用TCGA-COAD数据进行基因集富集分析（GSEA），发现一些免疫相关通路，如适应性免疫反应、细胞杀伤、细胞因子产生和T细胞激活，在簇2中富集。这表明簇2在免疫反应中可能比簇1更为活跃。

接下来，我们使用ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA方法比较了这两个簇的免疫特征。在ESTIMATE分析中，簇2的基质、免疫和ESTIMATE评分均高于簇1，表明簇2具有活跃的肿瘤免疫微环境。在CIBERSORT分析中，我们发现簇2中CD8 T细胞和M1亚型巨噬细胞的比例显著升高。先前的研究表明，CD8 T细胞在大多数肿瘤浸润免疫细胞亚型中对患者预后具有最强的影响（39）。在ssGSEA分析中，25种免疫细胞亚型在簇2中显著高表达，包括CD8 T细胞、辅助T细胞（CD4）、树突状细胞（DCs）、自然杀伤（NK）细胞、自然杀伤T（NKT）细胞和巨噬细胞。肿瘤浸润的T细胞对CRC的临床特征有重大影响。CD8 T细胞的高浸润可以预测对药物的反应，并改善CRC及肝转移患者的生存（40）。先前的研究表明，Th1高表达患者的预后较长，而Th17高表达患者在CRC中预后较差。此外，Th1的影响似乎超过了Th17对生存的影响（41）。DC被认为是促进抗肿瘤免疫的关键抗原呈递细胞，通过激活T细胞来发挥作用（42）。此外，常规1型树突状细胞在NK细胞刺激后被招募到肿瘤微环境中（43）。后者在抗肿瘤免疫中具有细胞毒能力，其广泛的浸润导致CRC的良好结果（44）。NKT细胞可以在抗PD-1耐药的肿瘤模型中重新激活耗竭的CD8 T细胞，因此在抗肿瘤免疫中发挥重要作用（45）。先前的研究表明，高NKT细胞浸润是CRC的一个独立有利预后因素（46）。巨噬细胞通常分为M1（促炎性；抗肿瘤）和M2（抗炎性；促肿瘤）亚型。根据CIBERSORT分析的结果，簇2中的M1亚型巨噬细胞比例高于簇1，这表明簇2更容易实现抗肿瘤的Th1型反应，而簇1则倾向于建立耐受性微环境（47）。基于我们对免疫构成的研究，簇2的免疫细胞浸润比簇1更广泛。因此，簇2可能具有更强的免疫能力，更可能从免疫治疗中受益。

先前的研究报告表明，程序性死亡1（PD1）、程序性死亡配体1（PDL1）和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA4）已被FDA批准作为免疫检查点抑制剂（ICIs）的靶点（48）。此外，淋巴细胞激活基因-3（LAG3）、T细胞免疫球蛋白-3（TIM3）和T细胞免疫球蛋白及ITIM结构域（TIGIT）被视为共抑制受体靶点（49）。在本研究中，我们比较了两组免疫调节药物，这些药物已被纳入转移性CRC的临床试验（48）。大多数这些靶点在簇2中的表达显著较高。接下来，我们分析了这两个簇的突变谱，发现它们之间存在显著差异。我们发现簇2的肿瘤突变负担（TMB）高于簇1。TMB可能影响免疫原性肽的生成，从而影响免疫治疗的反应（50）。此外，CRC可以根据微卫星不稳定性（MSI）和错配修复（MMR）分为两组，即dMMR MSI-H和pMMR-MSI-L。dMMR-MSI-H患者的特征是评估免疫治疗反应的特定生物标志物。除了由dMMR-MSI-H引起的高突变率外，POLE校对域突变也导致显著的高突变率，这可能导致良好的预后（48）。我们的研究表明，簇2的MMR相关基因（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）和POLE/POLD1的突变我们的研究表明，簇2的MMR相关基因（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）以及POLE/POLD1的突变率高于簇1，因此暗示簇2在免疫治疗中可能会表现出更好的效果。接下来，我们进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），以确定在ALKBH5/YTHDF1和免疫评分方面两个簇之间不同的蓝色模块。基于模块成员（MM）和基因集（GS），我们从该模块中获得了14个基因，包括PD1（PDCD1）和LAG3。已有研究报告了PD1和LAG3之间的明确协同作用，它们共同介导T细胞耗竭（51）；这可能发生在簇2中。因此，我们推测簇2通过评估免疫细胞的浸润程度、免疫检查点抑制剂（ICI）表达和突变负担，可能会比簇1获得更好的免疫治疗反应；这种差异可能是由于ALKBH5和YTHDF1介导的m6A修饰造成的。基于免疫特征，簇2被认为是“热肿瘤”，而簇1则倾向于是“冷肿瘤”（52）。由于我们的RT-qPCR结果验证了在12对癌症和正常组织中ALKBH5和YTHDF1的表达，我们推断簇1代表了COAD的整体免疫学特征，显示出较差的免疫反应。ALKBH5和YTHDF1可能在COAD中冷肿瘤向热肿瘤的转化中发挥潜在作用。尽管综合分析提高了我们对ALKBH5/YTHDF1与免疫之间关系的理解，并且我们使用了566名患者的GSE39582作为外部验证集，但当前研究仍存在一些局限性。首先，这是一项回顾性研究。因此，未来应进行前瞻性研究，以避免与回顾性研究相关的分析偏差。此外，该研究基于TCGA和GEO进行；我们无法从蛋白水平上说明ALKBH5和YTHDF1的表达或证明ALKBH5/YTHDF1在抗肿瘤免疫中的直接机制。因此，需要进一步研究以揭示直接机制。

结论

通过基于ALKBH5和YTHDF1的表达对TCGA-COAD和GSE39582的患者进行聚类，我们证明了簇2（ALKBH5：高表达；YTHDF1：低表达）相比于簇1（ALKBH5：低表达；YTHDF1：高表达）具有更多的免疫细胞浸润、ICI靶点表达、肿瘤突变负担（TMB）和dMMR-MSI-H的比例，从而表明簇2对免疫治疗的反应更好。我们的发现表明ALKBH5和YTHDF1在肿瘤免疫中具有潜力，并为m6A修饰与免疫之间的关系提供了新的见解。

免疫检查点抑制剂靶点表达

数据可用性声明

本研究中呈现的原始贡献包含在文章/补充材料中。进一步的询问可以向通讯作者提出。

伦理声明

涉及人类参与者的研究已由中国医科大学第一医院的机构伦理委员会审查和批准。患者/参与者提供了书面知情同意参与本研究。

作者贡献

GY设计了研究并撰写了手稿。YA进行了文献检索并收集了手稿数据。BX分析了数据。NW编辑了图表。MS和XS修订了手稿。所有作者均对文章做出了贡献并批准了提交的版本。

资助

本工作得到了中国国家自然科学基金（81670506）的支持。

致谢

作者感谢中国医科大学第一医院的胃肠科及TCGA和GEO网络的贡献。

补充材料

本文章的补充材料可以在以下网址找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.670490/full#supplementary-material

补充图1 | 对应于k = 2的共识矩阵的热图。
补充图2 | 两个簇与共识分子亚型（CMS）之间的关系。
补充图3 | 两个簇的生存分析。
补充图4 | 热图显示两个簇之间28种免疫细胞亚型的整体情况。

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